ПЦР диагностика. Что это такое в гинекологии, при гепатите, туберкулезе. Расшифровка анализов, как сдавать, стоимость

История

В начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров [1]. Однако в то время эта идея осталась невостребованной.

Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию[2].

https://www.youtube.com/watch?v=https:tv.youtube.com

В начале использования метода после каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г.

она была существенно улучшена. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий [3]. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой.

Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3’→5′ экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

ПЦР диагностика. Что это такое в гинекологии, при гепатите, туберкулезе. Расшифровка анализов, как сдавать, стоимость

В момент изобретения метода Маллис работал в компании Цетус (en:Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош (en:Hoffmann-La Roche) за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в 1980 году [4], в связи с чем компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент [5]. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г.

Что представляет собой данный анализ

Данный вид исследования относится к современным и высокотехнологическим способам диагностики. Сдавать анализы методом ПЦР следует в лабораториях, которые обладают всем необходимым комплексом для получения полноценных результатов. Не меньшую роль играют квалифицированные, подготовленные кадры. Отдайте предпочтение крупными, серьезным, известным лабораториям. Это поможет не только получить результаты быстро, но и обеспечит их достоверность.

Вся совокупность генетической информации, которой располагает любой живой организм, содержится в ДНК. Указанную нуклеиновую кислоту составляют четыре соединения. Идентифицировать живое создание совсем несложно: у каждого из них, независимо от параметров (будь то бактерия, животное, рыба), имеется своя уникальная ДНК.

Некоторые же микроорганизмы хранят генетические сведения о себе в РНК.

Фрагменты обоих нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) можно выявить посредством полимеразной цепной реакции, которую также именуют ПЦР.

В основе рассматриваемого тестирования – использование специальных ферментов, благодаря которым осуществляется копирование некоторых участков ДНК/РНК вирусных, микробных, иных инфекций.

ПЦР диагностика. Что это такое в гинекологии, при гепатите, туберкулезе. Расшифровка анализов, как сдавать, стоимость

Источником указанных возбудителей может служить практически любой биологический материал, взятый у человека: слюна кровь, моча, выделения из уретры или влагалища и т.д.

Так как в образцах крови и других биологических материалах содержание нуклеиновых кислот весьма низко, при помощи иных методов исследования выявить конкретное заболевания невозможно. В ходе ПЦР можно достичь увеличения уровня ДНК молекул, что обеспечивает достоверную постановку диагноза в будущем.

Для проведения анализа лаборанты применяют специальное оборудование – амплификатор. Данный прибор нагревает и охлаждает пробирки, в которые помещен биоматериал. Адекватный температурный режим прямо влияет на точность полученных результатов.

https://www.youtube.com/watch?v=ytpolicyandsafety

В итоге ПЦР лаборанты получают электрофореграмму, на которой зафиксированы фрагменты выделенных нуклеиновых кислот.

Указанное изображение сверяют с базой данных на компьютере — и таким образом определяют тип возбудителя, его концентрацию в организме.

Как выполняется и что может показать общий анализ крови — расшифровка результатов и нормы

Метод ПЦР применяется не только в медицине. Его используют в археологии, генетике, криминалистике. Разработчиком этого вида диагностики является американский химик Кэри Мюллис – лауреат Нобелевской премии. Кстати, самую престижную международную награду он получил за открытие метода ПЦР.

Благодаря полимеразной цепной реакции у ученых появилась возможность определять сходство ДНК, устанавливать отцовство и родственные связи. И все же основным предназначением мазка методом ПЦР принято считать диагностику инфекционных заболеваний у человека.

Полимеразная цепная реакция представляет собой высокоточный способ молекулярно-генетического исследования, проведение которого позволяет выявлять вирусные, генетические и наследственные патологии. Преимущество данной методики заключается в возможности определения болезнетворных агентов не только на острой или хронической стадии заболевания, но и в инкубационный период, то есть до того, как проявятся первые симптомы патологии.

Мазок на ПЦР никогда не дает ложноположительного ответа. Этим и отличается данный метод диагностики от других. Если инфекции в организме нет, пациент не получит положительный результат – в этом можно не сомневаться. Сегодня анализ на полимеразную цепную реакцию сдают с целью определить тип возбудителя и его количество.

Способ подготовки зависит от того, какой именно биоматериал необходимо сдать на исследование:

  • Если для анализа требуется образец слюны, то процедуру проводят натощак. За несколько часов до исследования нельзя принимать лекарственные препараты. Кроме того, нежелательно пить много жидкости, тем более горячей, чтобы не нарушить естественный состав микрофлоры ротовой полости.
  • Мочу для ПЦР необходимо собирать с утра. Для этого необходимо подготовить стерильный контейнер и тщательно подмыться. Материал не должен содержать посторонних примесей, поэтому мужчинам во время мочеиспускания необходимо оттянуть крайнюю плоть, а женщинам – закрыть влагалище ватным тампоном.
  • За три дня до сдачи спермы мужчине необходимо отказаться от сексуальных контактов. В период подготовки нежелательно посещать баню, принимать горячую ванну, употреблять алкоголь, острые блюда. Перед сбором биоматериала нельзя мочиться, поэтому за сутки до анализа желательно ограничить потребление жидкости.
  • Кровь, как уже было отмечено, сдавать нужно с утра, натощак. За 2-3 дня до анализа желательно отказаться от жирной пищи, алкоголя и сильнодействующих медикаментов.

Проведение ПЦР

Продолжительность подготовки результатов рассматриваемого вида тестирования будет определяться возможностями лаборатории, в которой его будут проводить.

Чаще всего на расшифровку уходит1-2 дня. Однако, в экстренных ситуациях ПЦР может быть выполнен в течение нескольких часов.

Вычленение ДНК является самым первым этапом проведения ПЦР-диагностики. Заключается он в следующем: забранные у больного образцы обрабатываются специальным образом, в результате чего сдвоенная спираль ДНК расщепляется на несколько нитей. Стоит отметить, что с целью обеспечения чистоты реакции в образцы добавляется определенная компонента, позволяющая растворить всю органику. Именно этим способом удаляются аминокислоты, углеводы, липиды, пептиды, полисахариды и белки. Вследствие всех этих манипуляций создается ДНК.

Необходимость подобных мероприятий обуславливается, прежде всего, тем, что в основе ПЦР-диагностики инфекций лежит создание новых ДНК или РНК инфекций. И, конечно, осуществить это, не удалив клеточный материал, нельзя.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

ПЦР диагностика. Что это такое в гинекологии, при гепатите, туберкулезе. Расшифровка анализов, как сдавать, стоимость

В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp[6]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов.

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
  • Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
  • Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
  • Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Ионы Mg2 , необходимые для работы полимеразы.
  • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

https://www.youtube.com/watch?v=ytdev

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию [8].

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг [9]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. Tm это температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Температуру плавления можно приблизительно определить по формуле , где nX — количество нуклеотидов Х в праймере.

Амфипликатор для ПРЦ-диагностики

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

  • GC-состав ~ 40—60 %;
  • близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
  • отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек[10] и димеров[11];
  • желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

Амплификатор

alt

Рис. 1: Амплификатор для проведения ПЦР

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C.

Как уже было сказано, мазок ПЦР у мужчин берут из мочеиспускательного канала. Чтобы получить необходимый биоматериал, врач-уролог использует специальный тонкий зонд и вводит его на глубину 3-4 см. Процесс взятия мазка ПЦР на уреаплазму, гонорею и другие распространенные возбудители может принести боль и значительный дискомфорт.

  • Мужчина освобождает половые органы от одежды.
  • Прежде чем вводить зонд в уретру, врач надевает одноразовые перчатки и осуществляет визуальный осмотр кожных покровов, слизистых оболочек на предмет высыпаний.
  • Затем с помощью инструмента уролог берет мазок методом ПЦР из мочеиспускательного канала. Зонд вводится на 3-4 см в глубину уретры и несколько раз прокручивается.
  • После извлечения зонда врач делает мазок на предметном стекле, которое впоследствии и отправит в лабораторию.

Помимо болезненных ощущений, процедура взятия соскоба вызывает у мужчин психологический дискомфорт. У тех, кто посещает уролога регулярно, подобных проблем не возникает. Кроме того, имеет значение правильная подготовка к мазку ПЦР. Она заключается в соблюдении следующих условий:

  • За несколько дней до анализа мужчине нужно отказаться от интимных связей.
  • Мазок берут в утренние часы.
  • Перед процедурой мужчине не нужно проводить гигиену половых органов, лучше всего принять душ с вечера.
  • За три часа до взятия образца биоматериала нельзя посещать туалет.

Так же, как и у женщин, сильнодействующие препараты могут исказить результат анализа на полимеразную цепную реакцию.

Способ проведения ПЦР – лабораторное установление инфекции в образцах, изолированных от пациента (ин витро).

Чтобы провести полимеразную цепную реакцию, требуется набор особых реактивов.

Исследуемый материал вносится в пробирки с реактивами. Пробирки ставят в специальный аппарат – амплификатор ПЦР, который предназначен для амплификации (повышения количества) искомых фрагментов РНК или ДНК, ПЦР амплификатор работает в циклическом режиме. При любом цикле, если в образцах имеется последовательность РНК или ДНК возбудителя, то в растворе все больше накапливаются копии частиц данных нуклеиновых кислот. Определить можно и присутствие возбудителя, и количество его в образцах.

Достоинства ПЦР

Ни один из методов исследования не способен найти возбудителя непосредственно в гене, содержащемся в исследуемых материалах. ПЦР – это максимально точный и достоверный анализ на венерические заболевания и латентные вирусы в организме. В отличие от иных способов диагностики, анализ полимерной цепной реакции имеет ряд преимуществ:

  • он нацелен на обнаружение возбудителя инфекции;
  • является универсальным, поскольку позволяет выявлять сразу несколько типов инфекционных агентов;
  • при этом достаточно использования только одного биологического образца пациента;
  • обладает сверхчувствительностью, за счет чего вероятность возможных перекрестных реакций равняется нулю.

https://www.youtube.com/watch?v=ytcopyright

Основные недостатки метода полимеразной цепной реакции

К основным недостаткам метода полимеразной цепной реакции относятся:

  1. Необходимость грамотного подхода к подбору последовательности праймеров. Конечно же, в лабораториях используются программы, существенно упрощающие поиск требуемых регионов ДНК, однако ни одна из имеющихся методик не гарантирует хорошую работу праймеров, ведь фактически они являются набором молекул разнообразного состава и длины.

    Это является причиной возникновения «минусовых» фракций, представляющих собой молекулы, последовательность которых укорочена на одно или несколько оснований, причем местоположение пропущенного нуклеотида в данной ситуации может быть любым. Именно поэтому получить качественный результат можно только после того, как эти фракции будут очищены.

  2. Сложности со смешиванием 4-х видов нуклеотидов. Различная пропорция нуклеотидов может повлечь за собой значительное увеличение ошибок ДНК-полимеразы в ходе амплификации. Именно поэтому в ходе ПЦР-анализа на инфекции требуется следить за концентрацией ионов магния ввиду того, что уменьшение катионов оказывает влияние на специфичность и температуру гибридизации праймеров.
  3. Необходимость соблюдения определенных технологий, а также тщательного соблюдения всех этапов исследования в изолированных друг от друга лабораторных зонах, обусловленная риском амплификации незначительных объемов неспецифических ДНК, способных привести к постановке неверного диагноза. Кроме того, ПЦР-анализ на инфекции больше используется для получения ответов на поставленные вопросы по принципу «да-нет», а именно о том, присутствует ли в образце возбудитель того или иного заболевания.

    А вот для определения того, какой микроорганизм из огромного количества существующих имеется в образце, этот анализ подходит замечательно. Обуславливается это тем, что метод ПЦР наиболее эффективен тогда, когда тестовая реакция содержит одну или несколько пар праймеров. Если же в одной реакции задействовано большее количество пар праймеров, соответствующих разнообразным инфекциям, появляется проблема, связанная с возникновением артефактов.

  4. Возможность неправильной интерпретации результатов анализов, связанная с тем, что определение ДНК возбудителя далеко не во всех случаях свидетельствует о том, насколько он жизнеспособен, а также о непосредственной связи обнаруженного инфекционного агента с тем или иным патологическим процессом.
  5. Возможность получения неверного результата в случае неправильного забора биоматериала. Строго говоря, для того, чтобы произвести качественный ПЦР-анализ, необходимо правильно забрать образцы биоматериала у пациента и правильно их подготовить.
  6. Необходимость максимально полного удаления антикоагулянтов и остатков гемма во время извлечения нуклеиновых кислот с целью обеспечения максимальной эффективности амплификации.
  7. Склонность ДНК-полимераз, используемых в ПЦР, к ошибкам.
alt

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (1) и продукты ПЦР-реакции (2,3). Цифрами показана длина фрагментов ДНК в парах нуклеотидов

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (рис. 2).

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3′-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C.

ПЦР диагностика. Что это такое в гинекологии, при гепатите, туберкулезе. Расшифровка анализов, как сдавать, стоимость

Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

alt

Рис. 2: Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96°C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n, где n — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1 E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато» [12].

Какие инфекции выявляет диагностика методом ПЦР

Главными преимуществами рассматриваемого тестирования являются его надежность и достоверность.

Расшифровка ПЦР-диагностики дает возможность:

  • Наиболее точно определить наличие/отсутствие инфекции в организме.
  • Диагностировать разновидность вирусного агента.
  • Отыскать бактерии даже при минимальном количестве вражеских ДНК во взятом биоматериале.

На сегодняшний день к числу ПЦР инфекций можно отнести:

  • пневмонию и дифтерию бактериальной и вирусной формы, туберкулез;
  • болезни ЖКТ, обусловленные присутствием в организме бактерии Helicobacter Pilori;
  • болезни, обусловленные наличием в организме сальмонеллы, холерного вибриона, боррелий;
  • инфекции, носящие вирусный характер, например, ВИЧ, вирусы папилломы человека, герпеса, гепатита, онковирусы и ретровирусы;
  • инфекционный мононуклеоз;
  • заболевания, обусловленные генетическими особенностями человека;
  • ЗППП, например, гарднереллез, уреаплазмоз, микоплазмоз, хламидиоз, трихомониаз;
  • клещевой энцефалит;
  • цитомегаловирусную инфекцию;
  • кандидоз;
  • листероз и многие другие заболевания, на протяжении многих лет способные присутствовать в человеческом организме в скрытом виде.

Популярность данного метода состоит в простоте и широте использования. Он применяется клиницистами для диагностики различных заболеваний. Позволяет быстро проводить сложные количественные и геномные исследования.

Одним из наиболее важных медицинских применений классического метода ПЦР является обнаружение микроорганизмов, которые способны вызывать патологические состояния.

Метод ПЦР помогает выявить вирусы, бактерии и грибки.

Наиболее распространённые болезни, которые можно диагностировать с его помощью:

  • инфекционные неврологические заболевания (менингит, миелит);
  • злокачественные процессы (лейкемия, лимфома);ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов
  • вирусные заболевания (ВИЧ, вирус папилломы человека, цитомегаловирус, энтеровирус, вирусные гепатиты, краснуха, аденовирусы и др.);
  • бактериальные инфекции;
  • заболевания, передающиеся половым путём (уреплазмоз, хламидиоз, трихомониаз);
  • заболевания, вызванные грибками (кандидоз, микоплазмоз);
  • герпес;
  • болезнь Филатова;
  • туберкулёз, пневмония, дифтерия как вирусного, так и бактериального происхождения;
  • болезни желудка, спровоцированные хеликобактерной инфекцией и другие.

Метод ПЦР для диагностики ВИЧ-инфекции является дорогостоящим анализом и используется по особым показаниям. К ним относится донорство, а также он может быть назначен пациентам, пострадавшим в автомобильной аварии с людьми, носителями ВИЧ.

ПЦР помогает установить наличие инфекции на ранних сроках до того, как организм выработает антитела к ВИЧ. Результат с высоким процентом вероятности исследование может показать уже через 5-14 дней после проникновения вируса.

В других случаях наличие вируса в организме человека помогает установить имунноферментный анализ (ИФА). Он определяет антитела к ВИЧ в крови человека, которые начинают вырабатываться через 1-3 месяца после заражения. Количественное определение анализ микроорганизмов необходимо для контроля лечения пациентов.

Вирусный гепатит С является тяжёлым заболеванием, которое может привести к развитию цирроза печени. В инкубационный период, который может составлять до 12 месяцев, вирус никак себя не проявляет, пациент практически не заразен, и вирус невозможно определить по обычному анализу крови.

https://www.youtube.com/watch?v=ytpress

Чаще всего, при несвоевременном лечении, заболевание переходит в хроническую форму и грозит множественными осложнениями.

Анализ мочи

При заражении гепатитом В, инкубационный период не так продолжителен и первые симптомы могут наблюдаться уже через 4 недели. Именно в этот период ИФА может показать присутствие вируса в организме.

Метод ПЦР позволяет:

  • выявить болезнь на этапе инкубационного развития;
  • разрешить сомнительные анализы других исследований;
  • оценить эффективность противовирусной терапии.

Отсутствие ДНК-вируса гепатита после проведённого лечения – признак его эффективности.

Диагностика на ВПЧ проводится в случае наличия симптомов заболевания таких как, папилломы и бородавки в области половых органов. Также исследование назначается на этапе планирования беременности, в случае бесплодия, выкидышей, а также в ситуации заражения одного из партнёров, так как один из механизмов передачи вируса – половой.

Наиболее опасным является не само присутствия вируса в организме, а его тип. Некоторые его виды (16 и 18) являются высокоонкогенными и могут вызывать рак шейки матки у женщин. Метод ПЦР может назначаться совместно с другими видами исследования. Для анализа чаще всего используют мазок из половых органов. Кровь, моча и выделения из влагалища в качестве биоматериала используются крайне редко.

В большинстве случаев ПЦР диагностика предоставляет высокоточные результаты. Но в некоторых случаях для подтверждения правильности диагноза требуются дополнительные методы исследования.

ПЦР диагностика производится в частных клиниках и лабораториях по назначениям врача или по инициативе самого пациента с целью профилактики. Предпочтение следует отдавать клиникам и лабораториям с современным оборудованием, которые существуют не первый год на медицинском рынке и зарекомендовали себя.

Палочка и контейнер для забора кала

ПЦР-исследование имеет стоимость, которая зависит от того, какая именно инфекция будет проверена, от методики анализа и исследуемого материала. Чтобы определить одну инфекцию, придется отдать в пределах 200-800 рублей. Также добавляется плата за взятие биоматериала – примерно 400 рублей.

Анализ мазка на ПЦР способен раскрыть любое количество инфекционных возбудителей в организме, включая «скрытые» вирусы, не проявляющие себя никакой симптоматикой в течение длительного времени. Этот диагностический метод применяют тогда, когда необходимо подтвердить или опровергнуть наличие у пациента:

  • вирусного гепатита;
  • уреаплазмоза;
  • хламидиоза половых путей;
  • вируса папилломы человека;
  • герпеса;
  • злокачественных клеток;
  • микоплазмоза;
  • вагиноза;
  • мононуклеоза;
  • трихомониаза;
  • ВИЧ-инфекции.

В качестве исследуемого материала для анализа на ПЦР используют кровь, слюну, мокроту, мочу. Перед процедурой взятия соскоба пациенту необходимо подготовиться к нему. О том, как подготовиться перед анализом ПЦР-мазка, пациенту сообщит лечащий врач. Как правило, специалисты проводят с больными соответствующую консультацию. Например, кровь сдают натощак, а непосредственно перед соскобом шейки матки нежелательно проводить гигиенические процедуры.

Разновидности ПЦР

  • «Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
  • «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
  • ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
  • Асимметричная ПЦР (англ.Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.
  • Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.
  • Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
  • Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.
  • Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ.Polony — PCR Colony) — акриламидный гельполимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
  • ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ.Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)
  • ПЦР длинных фрагментов (англ.Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3′-5′ эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.
  • RAPD PCR (англ.Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20 — 25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н — А, Т или С.

Как производится исследование методом ПЦР?

  1. Инструментарий, контейнеры для изъятого материала должны быть продезинфицированы. А лучше использовать одноразовые приспособления.
  2. Собранные образцы крови нужно помещать в пробирки, которые содержат антикоагулянты. А в процессе забора обращаются к специальным вакуумным системам.
  3. Забор любого биоматериала нужно осуществлять в манипуляционном кабинете.
  • Мaзки/сoскобы из шейки матки/уретры, утренняя мoча: при тестировании на патологии, которые передаются половым путем.
  • Крoвь: при тестировaнии на TORCH-инфекции, ВИЧ, гепатит.
  • Спиннoмозговая жидкoсть: при подозрении на дефекты в работе центральной нервной системе.
  • Мазoк из горла/зева: при проверке на цитомегаловирус, мононуклеоз.
  • Мoкрота/плевральная жидкость: при инфицировании легких.
  • Образцы ткани плаценты: для исключения либо подтверждения внутриутробной инфекции.

Перед началом ПЦР, ДНК должна быть выделена из образца. Выделение ДНК представляет собой многоступенчатый процесс, который может быть выполнен вручную или инструментально.

После подготовки образца начинается трехступенчатый процесс ПЦР:

  • разделение целевой ДНК (денатурация);
  • амплификация (размножение) ДНК-фрагментов;
  • детекция (выявление) амплифицированных фрагментов ДНК.

https://www.youtube.com/watch?v=upload

Первый этап ПЦР имеет название денатурация. Суть его состоит в том, что пробирку с ДНК образцами нагревают до высоких температур (приблизительно 90 градусов). Из-за высоких температур разрушаются слабые связи между нуклеотидами, образующими код молекул. В результате этого происходит разделение двухцепочечной ДНК или РНК на две отдельные нити.

Для «чистоты» исследования в исследуемый биоматериал добавляется специальный раствор, который растворяет органические вещества. Продолжительность данного этапа зависит от вида исследуемого материала и возбудителя инфекции.

ПЦР диагностика (что это такое, описано выше) на втором этапе осуществляет размножение ДНК-фрагментов на основе самой ДНК инфекции. ПЦР не копирует всю нуклеиновую кислоту в образце. Он копирует только особую последовательность генетического кода, короткий фрагмент (праймер).

На втором этапе пробирка охлаждается. Весь процесс ПЦР автоматизируется с помощью машины, называемой термостатом или амплификатором, и может быть завершен в течение нескольких часов. Машина ПЦР запрограммирована на изменение температуры реакционной смеси каждые несколько минут. Это происходит для того, чтобы короткие фрагменты смогли связаться с одноцепочечной матрицей.

Амплификация происходит в 30-40 циклов. В этот период врач-лаборант копирует ДНК-фрагмент и увеличивает его количество методом цепной реакции. Таким образом, с каждым циклом, количество копий возрастает до нескольких миллионов или даже миллиардов.

В третьей фазе исследования происходит выявление присутствия ДНК вирусов и бактерий. Это осуществляется путём распределения полученной смеси и добавления в неё специального раствора. Эта жидкость позволяет фрагментам ДНК приобретать определённую окраску под действием ультрафиолетовых лучей. Это и является индикатором того, что патогенные микробы присутствуют в организме человека.

В современной нам медицине исследование методом ПЦР производится в 4 этапа, включающих в себя:

  • получение биологического материала, требуемого для исследования;
  • вычленение ДНК;
  • амплификацию ДНК-фрагментов;
  • детекцию ДНК-продуктов амплификации.

Рассмотрим каждый из них более подробно.

Девушка делает анализы

Материалом для ПЦР-анализа могут быть практически любые биологические жидкости человека. Чужеродные ДНК болезнетворных микроорганизмов способны проникать в любую среду. Чаще всего в качестве образца для исследований применяется кровь и ее отдельные компоненты (плазма или сыворотка). В жидкой ткани могут присутствовать РНК вирусного гепатита, простого герпеса, цитомегаловируса, ВИЧ.

Широкие показания к исследованию имеют биологические жидкости. К ним относятся:

  • сок простаты;
  • сперма;
  • вагинальный секрет;
  • спинномозговая (ликвор);
  • амниотическая;
  • бронхоальвеолярный лаваж;
  • суставная жидкость;
  • слюна.

Для диагностики венерических заболеваний типа гонореи, хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомониаза, гарднереллеза, герпетических форм и др., у пациентов берут эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. У мужчин берут мазок ПЦР из уретры, а у женщин – из влагалища или шейки матки.

Отдельная категория – биоптаты. Чаще всего биоптаты исследуют с целью определения природы новообразования, подтверждения его злокачественности. Биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки требуются для выявления бактерии Хеликобактер пилори и ее количественной нагрузки.

Моча как биоматериал используется при инфекционных поражениях мочевыделительной системы. У мужчин мазок ПЦР нередко заменяют исследованием мочи, поскольку уретра у представителей сильного пола является универсальным элементом мочеполового тракта.

Для диагностики туберкулеза и обструктивных болезней легких исследуется мокрота. Материал могут собирать в стерильный флакон (15-20 мл) или брать мазок из зева. ПЦР-анализ также используют для выявления осложненных форм микоплазмоза и хламидиоза – при отсутствии лечения и других неблагоприятных факторов данные виды инфекции способны поражать респираторную систему человека.

Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии.

Рис. 3: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребенок. (3) Мать. Ребенок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Лаборант смотрит в микроскоп

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

https://www.youtube.com/watch?v=ytadvertise

Известно, что большинство лекарств действуют не на всех пациентов, для которых они предназначены, а лишь на 30-70 % их числа. Кроме того, многие лекарства оказываются токсичными или аллергенными для части пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных.

Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ.prospective genotyping).

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм.

В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

alt

Рис. 4: Клонирование гена с использованием плазмиды. .
(1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.

Секвенирование ДНК

В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Где сдать анализы на ПЦР

Исследовать в данном случае можно практически все биологические жидкости: мочу, кровь, слюну, спинномозговую жидкость, отделяемое слизистых оболочек и раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Забираются образцы для исследования ПЦР одноразовыми инструментами, после чего помещаются в стерильные пробирки из пластика или же на культуральные среды с последующим перемещением в лабораторию, занимающуюся этим видом исследований.

Сдача количественной ПЦР проводится в клинике, преимущественно с утра. Пациенту во время визита к врачу скажут, что необходимо сдавать: соскоб, мазов, мочу или кровь. ПЦР может определить возбудителей вне зависимости от уровня загрязнения материала.

Забор крови из вены

Для положительного анализа в теории требуется присутствие всего лишь одного возбудителя в образцах. На практике же стараются создать еще более благоприятные условия. Существуют для этого некоторые рекомендации:

  • если сдают соскоб или мазок из половых органов, нужно воздержаться от интимной связи за три дня до исследования;
  • нельзя перед анализом спринцеваться с антибактериальными препаратами или подмываться;
  • за три часа до взятия из уретры мазка нужно потерпеть и не опорожнять кишечник.

При сдаче крови пациентом таких правил можно не придерживаться.

Как расшифровываются результаты количественного анализа ПЦР?

Учитывая заболевание, симптомы и цели исследования ПЦР-диагностика может использовать любую жидкость физиологического характера или частичку ткани.

Это может быть:

  • кровь;
  • слюна;
  • мокрота;
  • моча;
  • испражнения;
  • мазок из ротоглотки;
  • кусочек поражённой ткани;
  • синовиальная жидкость;
  • соскоб из влагалища у женщин или из уретры у мужчин;
  • эякулят;
  • волосы и другие.

При заболеваниях мочеполовой системы берётся моча, мазок из влагалища у женщин или из уретры у мужчин. Венозная кровь сдаётся для диагностики таких заболеваний, как ВИЧ, гепатиты различных типов, TORCH-инфекции.

Для того, чтобы исключить или подтвердить онкологию, во время хирургических вмешательств изымаются кусочки ткани на биопсию.

Процедура взятия мазка

Количественная ПЦР в анализе крови обладает двумя особенностями.

  1. Анализ проводится в присутствии праймеров или дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, которые мечены посредством флуоресцентной или радиоактивной метки для точного определения содержания сформировавшегося продукта ПЦР.
  2. В процессе ПЦР следует рано завершать реакцию, пока не появилось слишком много продуктов ПЦР. Связано это с тем, что на конечной стадии насыщения, когда становится очень много продуктов ПЦР, лимитирующими звеньями данной реакции выступают как сам фермент, так и субстраты. Окончание очередного цикла ПЦР в таких условиях уже не характеризуется удвоением количества продуктов ПЦР, нивелируются незначительные количественные отличия между различными пробами, довольно четко определяемыми на ранних этапах после прохождения ряда циклов реакции.

При подозрении на то или иное заболевание, передающееся половым путем, врач может назначить женщине мазок на ПЦР. В лабораториях, которые относятся к бюджетным поликлиникам, такие анализы обычно не делают. Прежде чем выбирать место для исследования, необходимо убедиться, что там проводят необходимую диагностику.

Большинство из тех заболеваний, которые передаются половым путем, могут не проявлять себя в течение нескольких месяцев, поэтому отсутствие симптомов не является гарантией того, что девушка не заражена. Будучи носителем инфекции и не догадываясь о болезни, женщина может не только заразить партнера, но и упустить время для успешного лечения. Венерические заболевания могут приводить к бесплодию, воспалению органов малого таза и прочим осложнениям.

Мазок ПЦР на инфекцию назначается женщине в том случае, если имел место контакт с малознакомым партнером. Если венерический статус последнего неизвестен, значит, присутствует риск инфицирования. Сдача мазка на ПЦР целесообразна в случае, если:

  • женщина сомневается в «чистоте» своего нового партнера, так как во время полового акта не использовался презерватив;
  • в течение года у женщины было несколько половых партнеров;
  • у пациентки ранее было выявлено венерическое заболевание;
  • наступила беременность.

Обследование на половые инфекции является обязательным для будущих матерей, поскольку некоторые из них, даже если протекают скрыто и не дают о себе знать, могут нести серьезную опасность жизни и здоровью плода.

Кровь в пробирке

Соскоб у женщин берет врач-гинеколог. Сама процедура взятия соскоба на полимеразную цепную реакцию ничем не отличается от обычного гинекологического исследования на влагалищную флору. Процедура взятия мазка ПЦР на хламидии, трихомониаз, вирус папилломы человека, гонорею и другие половые инфекции происходит по стандартной схеме:

  1. Пациентка подготавливается к процедуре и занимает место на гинекологическом кресле.
  2. Для сбора материала гинеколог надевает одноразовые стерильные перчатки и производит осмотр наружных половых органов.
  3. Далее во влагалище женщины вводят специальный расширитель, который позволяет с помощью зеркала осмотреть внутренний эпителий.
  4. Для забора биоматериала используется специальная щетка, которая не обладает впитывающими свойствами и не способна повредить слизистые оболочки. С ее помощью берут соскоб с цервикального канала, стенок влагалища. Обыкновенная ватная палочка для этой цели не подходит.
  5. Использованный медицинский прибор, содержащий вагинальный секрет, вставляют в пробирку, закрывают и отправляют в лабораторию.

https://www.youtube.com/watch?v=ytabout

Процедура взятия соскоба обычно безболезненна, но иногда пациентки испытывают неприятные ощущения из-за контакта чувствительной слизистой с гинекологическими инструментами. Боль в процессе забора биоматериала может свидетельствовать о протекающем воспалительном процессе.

  • Вступать в интимную связь перед процедурой нельзя – после последнего контакта должно пройти не менее двух суток.
  • Если женщина проходит лечение антибиотиками или применяет вагинальные суппозитории, за три недели до взятия мазка ПЦР курс терапии необходимо завершить. В противном случае результат анализа может оказаться ложным.
  • Во время менструации мазок не берут.
  • Непосредственно перед забором биоматериала нельзя спринцеваться или использовать антибактериальное мыло.
  • Перед процедурой нельзя посещать туалет, последний раз помочиться можно за три часа до процедуры.

Конечная стоимость анализа будет зависеть от того, на какую инфекцию необходимо проверить пациента. В Москве на лабораторные исследования методом ПЦР установлены такие цены:

  • заболевания, передающиеся половым путем – анализ выполняется в среднем за 1-2 дня, стоимость составляет 300-500 руб. (за обнаружение одного возбудителя);
  • такие же сроки и цены установлены на диагностику методом ПЦР вируса Эпштейна-Барра, папилломы человека, герпеса, цитомегаловирусной инфекции;
  • обследование на гепатит A, B, C, D, G обойдется пациенту в 650-800 руб., за уточнение количественной нагрузки придется заплатить еще 2000 руб. (на выполнение исследования потребуется 4-5 дней);
  • подтверждение наличия в желудочном или кишечном биоптате бактерии Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) – 400-600 руб.;
  • антитела и антигены ВИЧ— 400-500 руб.;
  • количество РНК ВИЧ в образцах крови – более 10 тыс. руб.

С целью экономии врачи рекомендуют выбирать пакеты анализов — такие исследования обходятся дешевле. Услуги со скидками предоставляются в большинстве сетевых клиник, где делают анализы по методу ПЦР («СМ-Клиника», «Инвитро», «ОН-Клиник») и многопрофильных медцентрах.

Если в мазке обнаружились патогенные возбудители, не нужно отчаиваться. Главное – это как можно скорее начать терапию. Сегодня существует немало препаратов, благодаря которым даже пациенты с неизлечимыми болезнями имеют все шансы на высокое качество и нормальную продолжительность жизни. Выбор тактики лечения должен осуществлять врач. Самолечение при инфекционных заболеваниях недопустимо.

Амплификатор

Если вам интересно, как берут анализ ПЦР, то следует рассматривать каждый отдельный случай, учитывая тип биоматериала. Соскоб, мазок или забор крови имеет свои особенности, к примеру:

  • плазма сдается утром;
  • моча берется только первая утром, в лабораторных условиях в стерильный контейнер;
  • мазок или соскоб будет показателен только после воздержания от половых контактов не менее 3 суток;
  • нельзя сдавать мазок во время менструации и через 2 суток после нее.
  1. Если указанный материал извлекают из уретры, запрещены половые акты и использование антибактериальных средств для интимной гигиены за 3 дня до сдачи анализа. За 3 часа до тестирования нужно воздержаться от мочеиспускания.
  2. Кровь для исследований берут ранним утром на голодный желудок.
  3. Для тестирования мочи используют первую ее порцию после сна. Для данного анализа пациенту следует предварительно приобрести специальный контейнер в аптеке. Взятый биоматериал желательно доставить в диагностическую лабораторию через два часа.
  4. Мазок из влагалища лучше брать за пару дней до менструации, либо через 1-2 дня после ее завершения.
  5. Образец слюны нужно изымать только после тщательного полоскания (3 раза) ротовой полости физиологическим раствором.

Если есть возможность, взятый биообразец нужно сразу же отнести в лабораторию.

При невозможности срочной доставки, материал можно хранить короткое время в прохладном месте ( 4… 8 С).

Мазок на анализ

При необходимости длительного хранения некоторые виды биоматериалов можно замораживать, но — только единожды.

К контейнеру следует обязательно приложить направление доктора на ПЦР.

Общий анализ мочи — расшифровка результатов и физические свойства мочи

Суть анализа ПЦР

Для диагностики инфекций особенно часто применяются культуральные и серологические методы. Под первым определяются антитела к инфекционному возбудителю в сыворотке крови. При втором биологический материал, взятый от больного человека, применяют для засевания специфической среды, которая благоприятна для роста колоний возбудителя. Диагностика и в том, и в другом случае может длиться дни или недели.

Обследование ПЦР может проводиться с разными биологическими материалами, которые получают от больного человека. В виде образцов выступают кровь и прочие патологические, физиологические и биологические среды и жидкости. Можно сделать ПЦР кала или мочи.

Методом количественной ПЦР чаще всего диагностируют атипичные и вирусные инфекции, поскольку они могут не поддаваться простой диагностике из-за специфики спровоцированного ими патологического процесса. Для определения таких инфекций нужно время, на протяжении которого в организме начинают вырабатываться антитела, определяемые серологическими методами. Но это неприемлемо в ряде случаев.

ПЦР диагностика (что это такое, объясняется молекулярной биологией) является методом молекулярного клонирования, используемого для анализа короткой последовательности ДНК, которая присутствует в минимальных количествах в образцах, содержащих какой-либо генетический материал. Этот метод часто называют «копировальным аппаратом ДНК».

ПЦР диагностика осуществляется in vitro (вне тела) в лаборатории и основана на естественном процессе удвоения ДНК перед её делением. Кроме возможности обнаружить вирус, бактерию или другие микроорганизмы в образце, ПЦР позволяет идентифицировать их количество.

https://www.youtube.com/watch?v=ytcreators

При таких заболеваниях, как заражение вирусом гепатита С или вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусная нагрузка является хорошим показателем того, на каком этапе находится заболевание и насколько эффективной является терапия.

Вооруженные этой информацией, врачи могут определить, когда следует начинать лечение, а также контролировать сам процесс. Это позволяет составить индивидуальный подход для каждого пациента.

ПЦР диагностика включает три этапа, в каждом из которых количество ДНК-мишени увеличивается в разы. В результате такой реакции получается более одного миллиарда копий исходной или «целевой» ДНК, что и позволяет оценить присутствие вируса в организме. Это и является основным свойством метода ПЦР.

Особенности подготовки и проведения процедуры у мужчин

Еще один вопрос, который часто интересует пациентов: сколько стоит анализ ПЦР? Из-за новизны метода, необходимости приобретения дорогостоящего оборудования цена на тест относительно высокая. На стоимость ПЦР влияет вид инфекции, на которую будут проверять человека. Ориентировочная цена и сроки выполнения тестов следующая:

  1. ИППП проверят за 1 день, цена – 400-500 рублей.
  2. Герпес, ВПЧ, вирус Эпштейна-Барра, цитомегловирус выявляют за сутки, цена – 300-500 р.
  3. Анализ на гепатит проводится за 5 дней, цена на качественный вариант – 500 р., количественный – 2000 р.
  4. Хеликобактер пилори выявляют за сутки, цена – 400 р.
  5. Антигены, антитела ВИЧ, цена – от 380 р.
  6. Качественный анализ РНК ВИЧ, цена – от 3 500 р.
  7. Количественный анализ РНК ВИЧ, цена – от 11 000 р.

Преимущества и недостатки метода

ПЦР диагностика (что это такое, рассказано выше) была подробно описана Кери Муллисом в 1983 году. С тех пор метод пользуется огромной популярностью в лабораторной практике.

Основными преимуществами такого вида исследования является:

  • универсальность;
  • быстрота результатов;
  • высокая вероятность получения достоверных результатов;
  • специфичность;
  • многообразие заболеваний, которые можно определить.

Универсальность метода ПЦР состоит в возможности использования любых физиологических материалов человека. Даже одного волоса достаточно для анализа.

Процесс обработки данных, благодаря автоматизации, может занять несколько часов. Специфичность состоит в выделении определённого ДНК-фрагмента, характерного для конкретного возбудителя. С помощью ПЦР-анализа могут быть диагностированы многие заболевания, как в стадии обострения, так и в стадии скрытого течения.

Но, несмотря на огромное количество достоинств, метод диагностики ПЦР имеет и недостатки:

  • вероятность ложноположительных результатов;
  • высокая чувствительность;
  • изменчивость микроорганизмов.

Основной недостаток метода состоит в неспособности ПЦР отличить живые микроорганизмы от погибших. Как правило, это относится к ситуации, когда следует оценить успешность проводимого лечения. В этом случае, если болезнь пролечили, то мёртвые клетки ещё некоторое время находятся в организме человека и для полного его обновления необходимо некоторое время от 4 до 6 недель.

Высокая чувствительность является преимуществом и в то же время недостатком. Некоторые микроорганизмы в малом количестве присутствуют в организме. Поэтому в этом случае этот метод диагностики не является информативным, и рекомендуется применять другие типы исследования.

Любые микроорганизмы способны мутировать. И даже несмотря на то, что в процессе амплификации используется специфичный фрагмент, который наименее подвержен изменениям, он все равно может приобретать мутации и становиться невидимым для тест-системы. Такая ситуация объясняет тот факт, что различные системы лабораторных анализов могут показывать абсолютно разные результаты.

В каких сферах используется метод

Исследование ПЦР может применяться в клинической практике для идентификации различных заболеваний. Широко используется в гинекологии, урологии, гастроэнтерологии, онкологии и др.  Кроме того, он эффективно применяется в криминалистике для установления личности и при установлении отцовства.

title

Данный тип исследования используется на этапе планирования и во время беременности. Анализ на TORCH-инфекции проводится для того, чтобы выявить присутствие инфекции в организме женщины. Заболевания, вызванные одной из инфекций, могут протекать в легкой форме для женщины, но вызывать серьёзные врождённые дефекты плода, вплоть до его гибели.

Как расшифровывается ПЦР-анализ?

Ответ на вопрос о том, как расшифровывается ПЦР-анализ, волнует большинство из тех пациентов, кто сдал его впервые. В данном случае все достаточно просто. После того, как исследование будет закончено, пациент получает либо положительный, либо отрицательный результат. Естественно, что положительные результаты анализа будут говорить о наличии в организме той или иной инфекции, а отрицательные – о том, что в организме больного та или иная инфекция отсутствует, т.е. в биологическом материале, забранном у больного, ничего не было обнаружено.

Несмотря на кажущуюся простоту расшифровки, трактовать результаты анализов должен только ваш лечащий врач, который и назначил прохождение данного анализа. Причем расстраиваться в случае получения положительных результатов не стоит, ведь ПЦР методика в данном случае выявила заболевание, что означает, что в ближайшем времени будут приняты все меры по его скорейшему излечению. И главное здесь – не пытаться заниматься самолечением и не игнорировать этот процесс, растягивая срок болезни.

В принципе для того, чтобы разобраться в результатах лабораторного исследования на полимеразную цепную реакцию, не нужно обладать медицинским образованием. Расшифровать заключение экспертов достаточно просто. В ответах, которые выдают пациенту на руки, содержится информация о типе инфекции. Если возбудитель обнаружен, в заключении будет отмечен положительный результат. Он свидетельствует о наличии в организме исследуемого человека ДНК или РНК вируса.

Для эффективного лечения некоторых заболеваний необходимо иметь точные данные о количественной нагрузке, которая означает присутствие РНК-копий возбудителя на 1 мл крови. В большей степени определение количественной нагрузки важно при болезнях, спровоцированных условно-патогенной микрофлорой, поскольку инфекционные агенты активизируются и негативно воздействуют на организм человека только в том случае, если их количество превышает установленные пороги.

Как долго ждать ответ

Исследования на ПЦР отличаются максимальной точностью, специфичностью и чувствительностью. Мазок на полимеразную цепную реакцию позволяет узнать, есть ли в организме обследуемого конкретный тип инфекции, определить ее штамм и количество РНК-копий. Метод ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном содержании ДНК вируса в представленных образцах биоматериала.

Сроки выполнения анализа во многом зависят от того, какой из существующих методов полимеразной цепной реакции применяется в конкретной лаборатории. Самым простым способом изучения биологического материала считается микроскопический. Обычно этот метод исследования не занимает много времени. За срочность пациентам приходится платить дополнительно, но если по каким-либо причинам есть необходимость в проведении экстренного исследования, результаты могут выдать пациенту на руки спустя час.

Как подготовиться к анализу

ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов

Особенности подготовки к исследованию зависят от биоматериала, который сдаётся. Также следует помнить о том, что необходимо исключить приём антибиотиков и других медикаментозных средств. Для контроля эффективности лечения следует выдержать интервал после приёма препаратов не менее 4 недель.

Кровь сдаётся с утра натощак. Моча и кал должны быть помещены в предназначенный для этого, абсолютно стерильный контейнер. При этом, перед сбором мочи необходимо провести гигиену внешних половых органов.

Если сдаётся мазок, необходимо:

  • не мочиться в течение 3-х часов;
  • не рекомендуется подмываться и спринцеваться накануне (для женщин);
  • за сутки прекратить половую жизнь;
  • женщинам мазок следует сдавать в середине цикла.

ПЦР во время беременности

ПЦР диагностика (что это такое, описано выше) впервые может назначаться при беременности, так как является обязательной процедурой. Этот метод помогает выявить скрытые инфекции и угрозу развития пороков у плода.

Для проведения анализа используют:

  • мазок из влагалища;ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов
  • венозную кровь;
  • мочу;
  • околоплодные воды и ткань плаценты;
  • спинномозговую или суставную жидкость.

Существуют заболевания инфекционного характера, которые могут негативно влиять на развитие плода, вызывая пороки, стать причиной преждевременных родов и выкидышей.  Они особенно опасны в первом триместре беременности и, в большинстве случаев, являются медицинским показанием для прерывания беременности. Эти инфекции имеют общее название TORCH-комплекса.

Анализ ПЦР помогает установить наличие или отсутствие инфекции в организме беременной женщины. Зачастую проводится на этапе планирования беременности или в первом триместре. В случае положительного результата, требуется повторное проведение исследования. И только после подтверждения результатов, назначается соответствующее лечение.

Анализ на туберкулез

Развитие туберкулёза провоцирует палочка Коха, которая может попасть в организм человека воздушно-капельным путём. Заболевание имеет две формы: скрытую и открытую. В первом случае инфицированный человек не является носителем инфекции и микобактерии в мокроте не выявляются даже при помощи ПЦР. Опасность эта форма всё же имеет, так как способна переходить в открытую стадию.

Открытая (активная) стадия представляет опасность для окружающих даже в случае строгого соблюдения правил личной гигиены. Для диагностики заболевания используют флюорографию, томографию и рентген грудной клетки. Также с этой целью применяют кожную туберкулированную пробу (пробу Манту). Но наиболее эффективным методом исследования является ПЦР.

В качестве исследуемых образцов используют:

  • кровь;
  • мокроту;
  • жидкость бронхов.

При герпесе

Этот тест диагностирует генитальную инфекцию вирусом простого герпеса 1 и 2 типа (HSV1 / HSV2). При положительном результате HSV2, следует пройти тест на ВИЧ и другие ЗППП. Для анализа требуется венозная кровь пациента. Также может исследоваться моча, выделения и содержимое высыпаний при наличии симптомов.

Комплексное обследование ПЦР

В случае наличия показаний или же с целью профилактики заболеваний может быть назначен комплекс анализов методом ПЦР. Чаще всего инициатором выступает сам пациент, бывают случаи, когда комплексное обследование назначается для предотвращения вспышек определённых заболеваний в конкретном регионе.

ПЦР-12 – это комплексное исследование, которое охватывает следующие инфекции:

  1. Гепатит.
  2. ВИЧ.
  3. Герпес.
  4. ЗППП.
  5. Туберкулёз.
  6. Энцефалит.
  7. Кандидоз.
  8. Хеликобактерная инфекция.
  9. Цитомегаловирус.
  10. Мононуклеоз.
  11. Онковирусы.
  12. Листериоз.

Показатели и расшифровка результатов ПЦР

После проведения анализа методом ПЦР может быть озвучен положительный или отрицательный результат.

ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов
Результаты ПЦР диагностики выглядят вот так. Что это такое и как расшифровать расскажет врач

В случае положительного результата, рекомендуется повторная сдача анализов и количественное исследование ПЦР. Это помогает определить концентрацию инфекции в организме с целью назначения правильного лечения.

  • Положительный. Указывает на то, что в организме пациента присутствует чужеродные ДНК/РНК, а значит произошло заражение. Если у пациента нету каких-либо жалоб, в целом он чувствует себя хорошо, а результаты ПЦР-диагностики положительные, это свидетельствует о начальной стадии заболевания. При подобных ситуациях лечение не отнимет много времени и денег. В крайне редких случаях результат может быть ложноположительным: при нарушении правил антисептики в ходе забора биоматериала.
  • Отрицательный. Означает отсутствие искомых вирусных агентов во взятом образце. Ложноотрицательный результат может стать следствием человеческого фактора (в первую очередь – нарушение правил хранения биообразца, неправильный его сбор).

ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов

Количественная оценка исследуемого биоматериала дает возможность делать выводы о том, какой уровень нагрузки оказывают вирусы/бактерии на организм.

В ходе расшифровки определяют число чужеродных РНК или ДНК, которые концентрируются в 1 мл. крови (МЕ/мл).

Благодаря подобной методике, доктор имеет возможность распознать стадию и форму болезни, назначить адекватное лечение, определиться с его продолжительностью.

Повторный анализ зачастую назначают через 1 месяц после лечебных мероприятий.

Количественная оценка полученных результатов

Из вышенаписанного понятно, что такое ПЦР анализ и видны явные преимущества такого метода исследования. Еще один плюс данной диагностической процедуры – простота расшифровки результатов. Учитывая, сколько делается анализ ПЦР (сам процесс занимает около 5 часов, но лаборатория выдает данные через 1-2 суток), данный метод диагностики становится лучшим вариантом для определения множества инфекций. По результатам врач может сказать вам, что тест:

  1. Отрицательный – в исследуемом материале не было искомого возбудителя.
  2. Положительный – были найдены РНК, ДНК возбудителя.

Иногда проводится количественное определение микроорганизмов. Это необходимо при заболеваниях, которые вызывают условно-патогенные возбудители. Особенность этих вирусов в том, что проявляются они только при избыточном количестве и найти их обычными исследованиями крайне проблематично. Этот фактор важен для выбора терапевтической тактики, чтобы эффективно лечить вирусные инфекции, к примеру, гепатит, ВИЧ.

На 12 инфекций

Чтобы понять до конца, что такое ПЦР диагностика инфекций и насколько она эффективна, нужно узнать, что она способна выделять до 12 возбудителей. Проводится текст только в лабораторных условиях. Для исследования применяют специальные ферменты, которые увеличивают во много раз количество РНК, ДНК фрагментов вируса. Анализ ПЦР на 12 инфекций способен выявить:

  • микобактерии туберкулеза;
  • ВИЧ;
  • цитомегаловирус;
  • гепатит C, G, B, A;
  • герпес 1, 2 типа;
  • вирус Эпштейн-Барра (инфекционный мононуклеоз);
  • инфекции, которые передаются половы путем, к примеру, хламидии;
  • листериоз;
  • ВПЧ;
  • кандидозную инфекцию;
  • хеликобактер пилори;
  • боррелиоз, клещевой энцефалит.

На гепатит С

ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов

Этот диагностический метод помогает определить наличие вируса в крови. Это дает врачам возможность говорить о его наличии или отсутствии. Анализ ПЦР на гепатит С бывает двух видов: качественный и количественный. Первый вариант указывает только на его наличие и может иметь формулировку «обнаружен»/«не обнаружен».

Количественный анализ более точный и покажет концентрацию инфекции в крови. Обозначается этот показатель как «вирусная нагрузка», измеряется в количестве вирусной РНК на конкретный объем крови. Расшифровка в разных лабораториях может отличаться. Помимо измерения в МЕ/мл используются единицы измерения «копии».

На туберкулез

Делать тест следует в утреннее время. Это важно для того, чтобы не дать всему массиву мокроты, который образовался за ночь, выйти из желудка. Анализ ПЦР на туберкулез так же важен как ИФА, Манту, томографе. Тест помогает выделить наличие микобактерий, состояние мочи, общий иммуноглобулин, СОЭ, определить состояние легких на данный момент. Для точности получения результатов при анализе ПЦР необходимо проводить его с соблюдением следующих правил:

  1. Осуществляется посев 3 раза, но полную аспирацию содержимого желудка следует проводить только в условиях стационара.
  2. Выявляет микобактерии посев наличествующих масс в желудке менее чем в 50% диагнозов. Даже при получении оптимальных условий рекомендуется вместо них УЗИ.
  3. Даже при отрицательном характере результата не может быть полностью исключена вероятность развития туберкулеза с изменением СОЭ, иммуноглобулина или других показателей.
  4. Посев материалов при ПЦР менее восприимчив на патологические состояния, если получен он в рамках бронхоскопического обследования, который исключает подозрения на ТБ у ребенка.

На ВИЧ

Для многих людей данный диагноз считается смертельным приговором. По этой причине после частых половых связей человек становится более внимателен к сигналам, которые подает его тело (а иногда придумывает их). Самый надежный вариант получить подтверждение или опровержение данного заболевания – ПЦР анализ на ВИЧ. Тест можно использовать для определения следующих возможных проблем со здоровьем:

  1. Опровержение/подтверждение наличия ВИЧ в период серонегативного кона.
  2. Определение генотипа ВИЧ-1, ВИЧ-2.
  3. Уточнение описания патологического процесса при сомнительном результате иммуноблота.
  4. Заражение после переливания крови.
  5. Определения ВИЧ-статуса у детей, которые родились от матерей-носителей заболевания.
  6. Помогает установить наблюдение за вирусной загруженностью организма.

На ВПЧ

Вирус папилломы может быть выявлен у любого человека, долгое время он может находиться в латентном состоянии. Развитие провоцирует ослабление иммунитет, стрессы или эмоциональные всплески. Анализ ПЦР на ВПЧ помогает определить концентрацию вируса в крови. По этой причине рекомендуется проводить количественно определение, а не качественное. Эти данные помогут спрогнозировать вероятность развития злокачественного характера инфекции.

Методика диагностики наличия ВПЧ основывается на основном свойстве ПЦР выделять из материала ДНК вируса. Из-за высокой чувствительности теста даже небольшое количество бактерий будет обнаружено. Количественное исследование открывает врачам возможность установить степень опасности заболевания, составить прогноз на будущее.

На герпес

Данный вид диагностики в микробиологии помогает с высокой точностью проводить анализ ПЦР на герпес. Копирование фрагментов ДНК вируса будет происходить только, если в материале присутствует нужный ген. В данном случае тест по результатам проведения может указать на наличие или отсутствие возбудителя. Выявить его удастся даже при низкой концентрации в крови.

Еще один плюс анализа ПЦР в том, что он может определить герпетическую вирусную инфекцию сразу же после заражения, до появления клинической симптоматики. Можно определить тип герпеса (1 или 2), для сдачи анализа специфической подготовки не требуется, но врачи рекомендуют перед забором крови отказаться от:

  • жареного;
  • острого;
  • алкоголя;
  • жирного.

При беременности

При вынашивании ребенка очень важно провести данное исследования, чтобы поставить на учет состояние женщины. ПЦР анализ при беременности входит в перечень самых эффективных методов определения наличия разнообразных заболеваний. Провести тест нужно не только для выявления патологий, но и для определения вероятности заражения ребенка внутриутробно. Только благодаря ПЦР-диагностики стало возможным выявить степень прогрессирования, развитие множества инфекций внутри утробы матери.

Ложноположительные результаты могут получиться в результате несоблюдения правил сбора анализа и проведения самой процедуры исследования.

Сам пациент может быть виновником ложной информативности в случае ненадлежащей подготовки к сдаче биоматериала. Оснащённость лаборатории и профессионализм врача непосредственно могут влиять на результаты исследования.

В ряде клинических ситуаций появляется проблема эффективности проводимого лечения и/или динамики процесса патологии. Такие вопросы особенно актуальны при обследовании людей с хроническими инфекциями (вирус человеческого иммунодефицита, гепатиты В и С). При диагностике основываются на том, что накопление ампликонов (ПЦР продуктов) пропорционально наличию копий искомого гена в анализируемой пробе.

Конечно, учет результатов проведения количественной ПЦР делается посредством гель-электрофореза с исследованием интенсивность специальных сигналов ПЦР. Также обязательным условием верной количественной оценки полученных результатов являются положительные надежные контрольные пробы, содержащие известное количество копий искомого гена (к примеру, на одну ПЦР-реакцию тысяча копий гена гепатита С).

В определении количественной ПЦР ключевым достижением стало создание флуоресцентных ДНК-зондов, добавляющихся в реакционную смесь одновременно с простыми праймерами и позволяют отслеживать во времени процесс ПЦР, то есть real-time-ПЦР.

Под методологией TaqMan понимается синтез флуоресцентных ДНК-зондов, которые специфичны к средней части ампликона и имеют две метки на концах. Одной из них является флуоресцентная метка, вторая – молекула-гаситель данной флуоресценции.

Особый прибор, представляющий собой гибрид флуориметра и термоблока-амплификатора, производит постоянные замеры в каждой пробирке флуоресценции (принцип real-time-ПЦР). После 20-40 циклов ПЦР в результате для каждого образца будут получены индивидуальные кривые. Количество копий искомого гена, который содержится в исследуемом образце, может быть вычислено по калибровочным кривым с контрольными образцами.

ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов

Также важной особенностью осуществления ПЦР флуоресцентным методом является то, что пробирки со смесью ПЦР нет необходимости открывать при учете результатов. За счет этого снижается возможность заражения продуктами амплификации помещений, и необходимость в выделении особых рабочих областей для проведения электрофореза отпадает.

https://www.youtube.com/watch?v=https:accounts.google.comServiceLogin

Что показывает расшифровка количественной ПЦР?

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Koms24.ru
Adblock detector